Projekt AMBIEX - Ambient Air Pollution Exposure

V našem projektu budeme zkoumat toxicitu reálného venkovního vzduchu v lidských průduškách a čichové sliznici (zástupce účinků na mozek) od zdravých i nemocných dárců (astma, Alzheimerova choroba). Buňky budou pěstovány na rozhraní vzduch-kapalina (ALI = buňky rostou na membráně a jsou svým bazálním povrchem v kontaktu s médiem, zatímco svrchní část buněčné vrstvy je vystavena vzduchu) v našem expozičním systému ve venkovních podmínkách v různých lokalitách lišících se úrovní znečištění ovzduší.

• Modely sestávající ze směsí relevantních typů buněk pěstovaných na rozhraní vzduch a kapalina
• Přímé vystavení úplné směsi látek znečišťujících okolní ovzduší
• Žádné monokultury/monocelulární kultury
• Žádné testování na zvířatech
• Žádné částice se neoddělují z okolního vzduchu pomocí filtrů
• Žádné organické nebo vodní výtažky z částic

Reference jsou v textu uvedeny v hranatých závorkách. Seznam referencí naleznete na konci stránky.

Expozice škodlivinám v ovzduší je spojena se zvýšeným rizikem vzniku astmatu, s chronickou obstrukční plicní nemocí nebo zvýšenou úmrtností na rakovinu plic [23], Ipostihuje i další orgány v organismu včetně centrálního nervového systému, což má za následek zvýšené riziko např. Alzheimerovy choroby [24].

Náš projekt si klade za cíl prozkoumat biologickou odpověď lidských plicních a čichových buněk (přímá cesta vstupu látek do mozku) vystavených reálnému okolnímu vzduchu na rozhraní vzduch-kapalina a posoudit rozdíly v reakci mezi vzorky odebranými od zdravých a nemocných (astma a Alzheimerova choroba) jedinců v terénních podmínkách na čtyřech lokalitách ČR lišících se koncentracemi látek znečišťujících ovzduší (charakterizované koncentracemi prachových částic, ozonu, oxidů dusnatých, těkavých organických sloučenin a polycyklických aromatických uhlovodíků):

• trvale vysoké úrovně znečištění z několika zdrojů (Ostravsko)
• znečištění spojené s průmyslovou výrobou (výroba automobilů, severovýchodní Čechy)
• znečištění způsobené dopravou (Praha)
• pozaďová stanice s nízkou úrovní znečišťujících látek (Českomoravská vrchovina)

Během letošního léta proběhlo hodnocení kvality ovzduší na většině vybraných lokalit s předpokládanými různými koncentracemi znečišťujících látek. Jaké podmínky na jednotlivých lokalitách panovaly a co takové měření obnáší, můžete vidět v galerii níže.

Konkrétně pro zkoumání dopadů na plicní systém navrhujeme použít 3D model lidského epitelu horních cest dýchacích (MucilAirTM, Epithelix Sàrl, Ženeva, Švýcarsko) rekonstituovaný z tkání 8 zdravých dárců a 8 jedinců, u kterých bylo diagnostikováno asthma bronchiale. Model představuje plně diferencovaný a funkční respirační epitel skládající se z bazálních, pohárkových a řasinkových buněk [26].

Vzhledem k tomu, že čichová sliznice je považována za jednu z nejpřímějších cest vstupu látek znečišťujících ovzduší do mozku [27], budeme dále studovat účinky expozice znečištění ovzduší v buňkách lidské čichové sliznice (hOM) získaných od 8 zdravých jedinců a 8 Alzheimerovou chorobou (AD) pacientů (poskytováno spolupracující institucí – Prof. Katja Kanninen, University of Eastern Finland). Tyto kultury obsahují bazální buňky, buňky podpůrné a buňky podobné myofibroblastům získané z biopsie z nosní přepážky a dále zpracované, jak bylo popsáno dříve [28].

Tkáně MucilAirTM získané od 8 astmatických a 8 zdravých subjektů a hOM od 8 AD a 8 zdravých kontrol vystavíme okolnímu vzduchu po dobu až 6 hodin/den po dobu 5 po sobě následujících dnů. Jako kontrola čistého vzduchu bude použit syntetický vzduch.

Protože se ukázalo, že nepříznivá reakce na látky znečišťující ovzduší se u nemocných subjektů liší od reakce u zdravých jedinců [31], současná analýza obou typů vzorků zlepší kvalitu a obecnou platnost našich dat.

1. Porovnáme rozdíly mezi reakcemi zdravých a nemocných dárců a mezi expozicí čistému vzduchu a okolnímu vzduchu.
2. Navíc zkoumání odezvy ve vzorcích pocházejících od několika nezávislých subjektů bude simulovat interindividuální rozdíly mezi jednotlivci v lidské populaci. Dárci tkání budou odpovídat pohlaví, věku a kouření.

• Budou vyhodnoceny parametry cytotoxicity s cílem identifikovat optimální podmínky expozice (doba expozice/den; počet dnů expozice) pro další využití v projektu.
• Předpokládá se, že oxidační stres a zánět hrají hlavní roli v etiologii astmatu, stejně jako AD [29,30], a jsou spojeny s expozicí látkám znečišťujícím ovzduší. Zaměříme se tedy na analýzu vybraných markerů oxidačního stresu a imunomodulačních molekul.
• Také celogenomová exprese mRNA a miRNA bude analyzována sekvenováním nové generace (NGS, next-generation sequencing) na platformě Illumina. Konkrétně se zaměříme na identifikaci interakcí mRNA-miRNA a jejich vliv na mechanismy biologické odpovědi a na charakterizaci interindividuálních rozdílů v odpovědi.

V rámci projektu využijeme náš expoziční systém vyvinutý pro projekt MUCILTOX [25], který bude upraven pro použití v terénních podmínkách tak, aby byl vhodný pro přímou expozici komplexním směsím látek znečišťujících ovzduší.

Studie s názvem Mechanismy toxicity emisí benzinových motorů ve 3D tkáňových kulturách a modelová linie bronchiálních epiteliálních buněk (projekt č. 18-04719S) byla financována Grantovou agenturou ČR a byla zaměřena na účinky emisí benzinových motorů testovaných v laboratorních podmínkách.

V MUCILTOX jsme nasměrovali naše experimenty k aplikaci 3D modelů vypěstovaných na ALI [26][43–45] a vyvinuli jsme expoziční systém, který umožňuje expozici vybraného buněčného modelu pomocí ALI v reálném čase pro kompletní emise motoru v laboratorních podmínkách [25]. Pomocí tohoto systému jsme zkoumali biologické účinky expozice MucilAirTM a standardní buněčné linie bronchiálních epiteliálních buněk (BEAS-2B) celkovým emisím z běžných a alternativních paliv spalovaných v benzínových motorech [46,47]. Pozorovali jsme významné změny zánětlivých markerů ve 3D modelu vystavenému kompletním emisím z běžného benzínu [48].

1. Výsledky toxikologických analýz se budou významně lišit mezi buněčnými modely odvozenými od zdravých a nemocných jedinců a také bude záviset na původu modelů (plicní epitel vs. čichová sliznice).
2. Intenzita odezvy bude výraznější u buněčných modelů exponovaných v lokalitách se zvýšenými koncentracemi znečišťujících látek v ovzduší.
3. Znečištění okolního ovzduší v průmyslové oblasti vyvolá vyšší hladiny peroxidace lipidů a markerů zánětu než polutanty z jiných lokalit.
4. Typ znečištění ovzduší (smíšené vs. průmyslové zdroje vs. doprava) ovlivní míru exprese mRNA a miRNA.
5. U zkoumaných parametrů budou pozorovány podstatné interindividuální rozdíly, které budou výraznější u dat z genové exprese a u nemocných subjektů.

Působení znečištěného ovzduší na organismus mimo jiné přispívá ke zvýšenému výskytu plicních, kardiovaskulárních a neurodegenerativních poruch a je odpovědné i za zkrácení střední délky života [1–5]. V roce 2015 bylo znečištění venkovního ovzduší klasifikováno Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) jako karcinogenní pro člověka (skupina 1) [6].

Látky znečišťující ovzduší pocházejí jak z přírodních zdrojů (např. erupce sopek, lesní požáry), tak z lidských činností (silniční doprava, vytápění obytných domů, průmyslová výroba) a jejich koncentrace jsou zvláště vysoké v hustě obydlených oblastech.

Znečištěný vzduch obsahuje komplexní směs skládající se z plynných škodlivin [ozon, SO₂, CO, NOx, těkavé organické sloučeniny (VOC)], prachových částic (particulate matter, PM) různé velikosti a sloučenin na ně navázaných, včetně např. polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) a kovů. Podle aerodynamického průměru se PM dělí na hrubou (PM₁₀, ≤ 10 μm), jemnou (PM_2,5, ≤ 2,5 μm) a ultrajemnou (PM_0,1, ≤ 0,1 μm) frakci.

Toxicita znečištěného ovzduší tak vzniká spolupůsobením různých složek. Pro komplexní hodnocení biologických účinků látek znečišťujících ovzduší je zásadní uplatnění expozičních experimentů, které zahrnují kompletní směs látek znečišťujících ovzduší (komplexní plynné polutanty, částice s adsorbovanými sloučeninami v podobě, v jaké se vyskytují v atmosféře).

Studie prováděné přímo na lidské populaci poskytují nejlepší informace o účincích látek znečišťujících ovzduší na lidské zdraví. Ovšem takový výzkum je obvykle velmi nákladný a logisticky a eticky náročný [2]. V různých studiích byly tak použity alternativní přístupy založené na expozici laboratorních zvířat znečišťujícím látkám z městského ovzduší nebo silničního provozu [15–17]. Ačkoli jsou tyto studie snadněji proveditelné, stále vyžadují specifické podmínky a rozdíly mezi organismy experimentálních zvířat a lidským organismem komplikují extrapolaci údajů o zvířatech na člověka. Navzdory této skutečnosti se studie zkoumající in vitro toxicitu okolního vzduchu často omezují na vystavení buněčných kultur organickým nebo vodním extraktům z prachových částic nebo jsou částice separovány z okolního vzduchu pomocí filtrů nebo jiných metod [14].

V plicích jemné částice pronikají do alveol a mohou interferovat s výměnou plynů mezi vdechovaným vzduchem a krví [7], zatímco ultrajemná frakce vstupuje do jednotlivých buněk včetně subcelulárních struktur a může být distribuována do vzdálených tkání a orgánů prostřednictvím krevního oběhu. Velikost částic spolu s chemickým složením komplexní směsi určuje možné nepříznivé zdravotní účinky látek znečišťujících ovzduší na lidské zdraví.

Účinky zprostředkované prachovými částicemi (PM) jsou v organismu spojeny jak s fyzikálními vlastnostmi PM, tak s chemickým složením na ně adsorbovaných sloučenin. Přítomnost částic samotných přispívá k aktivaci imunitního systému, což může mít za následek produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) imunitními buňkami. ROS způsobují oxidační poškození makromolekul, včetně nukleových kyselin, indukují mutace, a tím zvyšují riziko tumorigeneze [9]. ROS navíc působí jako signální molekuly ovlivňující expresi genů zapojených do metabolické regulace nebo stresové reakce [10]. Některé ze sloučenin vázaných na PM, zejména polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), jsou pravděpodobně karcinogenní nebo karcinogenní pro člověka. Reaktivní meziprodukty PAH mohou být také metabolizovány na o-chinony, které vstupují do redoxního cyklu a způsobují oxidační stres tvorbou ROS [11]. Přítomnost přechodných kovů v PM dále přispívá k tvorbě ROS a oxidačnímu poškození makromolekul [12]. I když je vliv plynných složek znečištění ovzduší na lidské zdraví méně významný než u PM [13], dále potencují prooxidační vlastnosti a celkovou karcinogenitu znečištěného ovzduší.

Obecné

• Pro identifikaci biologických účinků expozice provedeme komplexní toxikologické hodnocení panelu relevantních biomarkerů, včetně parametrů cytotoxicity, markerů oxidativního stresu a zánětlivé reakce, stejně jako analýzu globální exprese mRNA a miRNA.
• Upravit a optimalizovat systém vystavení modelů buněk pěstovaných na rozhraní vzduch-kapalina znečištěnému venkovnímu ovzduší.
• Zkoumat biologickou odpověď modelu lidských průdušek a čichové sliznice na vystavení reálnému okolnímu vzduchu s různými koncentracemi látek znečišťujících ovzduší.
• Posoudit rozdíly v toxické odpovědi mezi buněčnými modely získanými od zdravých jedinců a těch, kteří trpí astmatem nebo Alzheimerovou chorobou.

Specifické

• Vystavit studované buněčné modely znečištěnému okolnímu ovzduší a syntetickému vzduchu na čtyřech lokalitách lišících se úrovní znečištění ovzduší.
• Posoudit základní markery toxicity (cytotoxicita, TEER, produkce mucinu), tvorbu ROS, indukci peroxidace lipidů a produkci zánětlivých mediátorů ve studovaných buňkách.
• Stanovit globální expresi mRNA a miRNA a zanalyzovat jejich vzájemné interakce při zkoumání dopadů expozice vnějšímu ovzduší na genom a epigenom.
• Zjistit rozdíly v reakci na expozici okolnímu vzduchu mezi zdravými subjekty a těmi, kteří trpí astmatem a Alzheimerovou chorobou.
• Vyhodnotit interindividuální rozdíly v reakci na znečišťující látky v ovzduší u zdravých i nemocných subjektů a spojit je s koncentracemi znečišťujících látek v ovzduší.

Pro další experimenty budou odebraná média a buněčné lyzáty skladovány při -80 °C.

• Pro hodnocení cytotoxicity budou použity testy laktátdehydrogenázy a adenylátkinázy.
• Tkáňová integrita kultur MucilAirTM bude hodnocena měřením transepiteliálního elektrického odporu (TEER).
• Produkce mucinu, parametr negativních účinků expozice okolnímu vzduchu, bude hodnocena v kulturách MucilAirTM metodou Sandwich enzyme-linked lectin assay.
• Produkce extracelulárních reaktivních forem kyslíku (ROS) bude testována Acridan Lumigen PS-3 Assay.
• Markery oxidace lipidů, 22 vybraných metabolitů kyseliny arachidonové a linolové, budou měřeny kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) externím spolupracovníkem.
• Panel 25 vybraných zánětlivých markerů (cytokiny, chemokiny a růstové faktory, včetně např. IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, TNFα, MCP-1, RANTES, GM-CSF, EGF nebo LIF) bude hodnocen multiplexním imunotestem v servisní laboratoři (Thermo Fisher Scientific).
• Celogenomová exprese mRNA a miRNA bude analyzována sekvenováním nové generace na platformě Illumina. Konkrétně se zaměříme na identifikaci interakcí mRNA-miRNA a jejich vliv na mechanismy biologické odpovědi a na charakterizaci interindividuálních rozdílů v odpovědi.

V naší předchozí práci jsme studovali in vitro účinky látek znečišťujících ovzduší pomocí standardních buněčných modelů (modelové plicní buněčné linie: alveolární epiteliální buňky A549; bronchiální epiteliální buňky BEAS-2B; embryonální plicní fibroblasty HEL), kultivované v médiu a exponované organickým látkám extrahovaných z prachových částic pocházejících ze znečištění okolního ovzduší a/nebo výfukových plynů motoru [32–42]. Nedávno jsme naše experimenty zaměřili na aplikaci 3D modelů buněk pěstovaných na rozhraní vzduch-kapalina (ALI = buňky rostou na membráně a jsou svým bazálním povrchem v kontaktu s médiem, zatímco svrchní část buněčné vrstvy je vystavena vzduchu [26][43–45] a vyvinuli expoziční systém, který umožňuje expozici buněk pěstováných v ALI systému emisím motoru v reálném čase v laboratorních podmínkách [25].

• [1] Z. An et al., Impact of Particulate Air Pollution on Cardiovascular Health, Curr. Allergy Asthma Rep. 18 (2018) 15.
• [2] S.C. Faber, S.D. McCullough, Through the Looking Glass: In Vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway, Appl. In Vitro Toxicol. 4 (2018) 115–128.
• [3] A. Combes, G. Franchineau, Fine particle environmental pollution and cardiovascular diseases,
  Metabolism. 100 (2019) 153944.
• [4] L. Calderón-Garcidueñas et al., Alzheimer disease starts in childhood in polluted Metropolitan Mexico City. A major health crisis in progress, Environ Res. 183 (2020) 109137.
• [5] L.O.J. Killin et al., Environmental risk factors for dementia: a systematic review, BMC Geriatr. 16 (2016) 175.
• [6] IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, International Agency for Research on Cancer, Outdoor air pollution, 2015.
• [7] A.A. Almetwally et al., Ambient air pollution and its influence on human health and welfare: an overview, Environ Sci Pollut Res. 27 (2020) 24815–24830.
• [9] J.E. Klaunig, Oxidative Stress and Cancer, CPD. 24 (2019) 4771–4778.
• [10] H. Sies, D.P. Jones, Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents, Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2020) 363–383.
• [11] B. Moorthy et al., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: From Metabolism to Lung Cancer, Toxicol Sci. 145 (2015) 5–15.
• [12] P. Moller et al., Oxidative stress and inflammation generated DNA damage by exposure to air pollution particles, Mutat Res. 762 (2014) 133–66.
• [13] R.B. Hamanaka, G.M. Mutlu, Particulate Matter Air Pollution: Effects on the Cardiovascular System, Front Endocrinol. 9 (2018) 680.
• [14] J. Zavala et al., New Approach Methods to Evaluate Health Risks of Air Pollutants: Critical Design Considerations for In Vitro Exposure Testing, IJERPH. 17 (2020) 2124.
• [15] R. Villarreal-Calderon et al., Urban Air Pollution Targets the Dorsal Vagal Complex and Dark Chocolate Offers Neuroprotection, Int J Toxicol. 29 (2010) 604–615.
• [16] A. Rowan-Carroll et al., Mice exposed in situ to urban air pollution exhibit pulmonary alterations in gene expression in the lipid droplet synthesis pathways, Environ Mol Mutagen. 54 (2013) 240–9.
• [17] I. Bos et al., Changed gene expression in brains of mice exposed to traffic in a highway tunnel, Inhal Toxicol. 24 (2012) 676–86.
• [22] C. Bisig, A. Petri-Fink, B. Rothen-Rutishauser, A realistic in vitro exposure revealed seasonal differences in (pro-)inflammatory effects from ambient air in Fribourg, Switzerland, Inhal Toxicol. 30
  (2018) 40–48.
• [23] O.K. Kurt et al., Pulmonary health effects of air pollution, Curr Opin Pulm Med. 22 (2016) 138–143.
• [24] S. Shabani, A mechanistic view on the neurotoxic effects of air pollution on central nervous system: risk for autism and neurodegenerative diseases, Environ Sci Pollut Res. 28 (2021) 6349–6373.
  GRIS ORBEON 1.3.6.2-SNAPSHOT 31 / 32 10.
• [25] M. Vojtisek-Lom et al., Assessing Exhaust Toxicity with Biological Detector: Configuration of Portable Air-Liquid Interface Human Lung Cell Model Exposure System, Sampling Train and Test Conditions, SAE Technical Paper 2019-24-0050. (2019).
• [26] T. Cervena et al., Short-term and Long-term Exposure of the MucilAirTM Model to Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, ATLA 47 (2019) 9–18.
• [27] K.M. Kanninen et al., Olfactory cell cultures to investigate health effects of air pollution exposure: Implications for neurodegeneration, Neurochem Int. 136 (2020) 104729.
• [28] F. Féron et al., New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons, Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (1998) 861–866.
• [29] A.J. Dozor, The role of oxidative stress in the pathogenesis and treatment of asthma, Ann N Y Acad Sci. 1203 (2010) 133–7.
• [30] John van Geest et al., (Eds.), Alzheimer’s Disease: Drug Discovery, Exon Publications, 2020: pp. 1–22.
• [31] Y.-C.T. Huang, A.J. Ghio, Controlled human exposures to ambient pollutant particles in susceptible populations, Environ Health. 8 (2009) 33.
• [32] K. Hanzalova et al., Oxidative damage induced by carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons and organic extracts from urban air particulate matter, Mutat Res. 696 (2010) 114–121.
• [33] P. Rossner Jr. et al., Nucleotide excision repair is not induced in human embryonic lung fibroblasts treated with environmental pollutants, PloS One. 8 (2013) e69197.
• [34] H. Libalova et al., Analysis of gene expression changes in A549 cells induced by organic compounds from respirable air particles, Mutat Res. 770 (2014) 94–105.
• [35] P. Rossner Jr. et al., Nonhomologous DNA end joining and chromosome aberrations in human embryonic lung fibroblasts treated with environmental pollutants, Mutat Res. 763–764 (2014) 28–38.
• [36] T. Cervena et al., DNA Damage Potential of Engine Emissions Measured In Vitro by Micronucleus Test in Human Bronchial Epithelial Cells, Basic Clin Pharmacol Toxicol. (2016).
• [37] H. Libalova et al., Comparative Analysis of Toxic Responses of Organic Extracts from Diesel and Selected Alternative Fuels Engine Emissions in Human Lung BEAS-2B Cells, Int J Mol Sci. 17 (2016).
• [38] P. Rossner et al., Toxic Effects of the Major Components of Diesel Exhaust in Human Alveolar Basal Epithelial Cells (A549), Int J Mol Sci. 17 (2016) 1393.
• [39] H. Libalova et al., Transcriptional response to organic compounds from diverse gasoline and biogasoline fuel emissions in human lung cells, Toxicol In Vitro. 48 (2018) 329–341.
• [40] B. Novotná et al., The genotoxicity of organic extracts from particulate truck emissions produced at various engine operating modes using diesel or biodiesel (B100) fuel: A pilot study, Mutat Res. 845 (2019) 403034.
• [41] P. Rossner et al., The processes associated with lipid peroxidation in human embryonic lung fibroblasts, treated with polycyclic aromatic hydrocarbons and organic extract from particulate
  matter, Mutagenesis. 34 (2019) 153–164.
• [42] P. Rossner et al., Genotoxicant exposure, activation of the aryl hydrocarbon receptor, and lipid peroxidation in cultured human alveolar type II A549 cells, Mutat Res. 853 (2020) 503173.
• [43] G. Hilton et al., Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model, Toxicol In Vitro. 54 (2019) 58–66.
• [44] H. Barosova et al., Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment, JoVE. (2020) 61090.
• [45] H. Barosova et al., Use of EpiAlveolar Lung Model to Predict Fibrotic Potential of Multiwalled Carbon Nanotubes, ACS Nano. 14 (2020) 3941–3956.
• [46] P. Rossner et al., The Biological Effects of Complete Gasoline Engine Emissions Exposure in a 3D Human Airway Model (MucilAirTM) and in Human Bronchial Epithelial Cells (BEAS-2B), Int J Mol Sci.
  20 (2019) 5710.
• [47] T. Cervena et al., Ordinary Gasoline Emissions Induce a Toxic Response in Bronchial Cells Grown at Air-Liquid Interface, Int J Mol Sci. 22 (2020) 79.
• [48] Rossner P, Cervena T, Vojtisek-Lom M, Neca J, Ciganek M, Vrbova K, Ambroz A, Novakova Z, Elzeinova F, Sima M, Simova Z, Holan V, Beranek V, Pechout M, Macoun D, Rossnerova A, Topinka J. Markers of lipid oxidation and inflammation in bronchial cells exposed to complete gasoline emissions and their organic extracts. Chemosphere. 2021 Oct;281:130833).